冻融交替

冷却离心管至室温
更新时间:2019-08-22 19:49 浏览:59 关闭窗口 打印此页

  制成匀浆反复冻融三次以促进组织细胞裂解病毒释放 然后 上清置于另一灭菌管内并加入用缓冲液或生理盐水稀释的青 霉素和链霉素终浓度为万单位每毫升 。冰箱放置 。在无菌环境下将病毒 孵化内正常死亡或未死亡的鸡胚在冰箱内放置一段时间使鸡胚的血管收缩 然后 无菌环境中收获尿囊液。反复传代 放置。备用。 病毒的血清学鉴定 无菌采集健康公鸡的抗凝血液制成 的红细胞 对保存的尿囊液进行红细胞凝集 试验 效价大于等于判定为阳性尿囊液 将具有血凝性的病毒分别与新城 疫、禽流感亚型、亚型、亚型和 阳性血清进行抑制反应。选 择亚型阳性血清抑制红细胞凝集阳性反应的尿囊液 保存备用。 病毒基因和基因的测序 引物设计 参照中已发表的亚型的基因设计引物 参考序列登录号 运用和设计了两对特异性引物序列 如下 预计扩增基因阅读框的全基因序列引物由上海生工生物技术有限公司合 参照中已发表的亚型的基因序列参考序列登录号为 运用 和设计一对特异性引物 引物序列如下 ’一一’ 山东农业大学硕士学位论文 预计扩增基因阅读框的全基因序列引物由上海生工生物技术有限公司合 法提取病毒总试剂和器材的处理 为了避免酶对的降解 提敢所需的所有耗材都需要经过 水的处理 管、枪头等用配好的水浸泡以上 高压灭菌 烘干备用。 病毒基因组的提取和纯化 取阳性尿囊液 的预处理的管内加入此 剧烈震 加入肚氯仿充分震荡 混匀至乳白色无分层。室温放置 离心机 离心 加入等体积的异丙醇反复颠倒离心管使溶液混匀。室温静置。 离心机 离心 弃去所有上清。 加入 的乙醇水处理 涡旋震荡 离心机 离心 弃去上清 再离心 小心吸去液体 将离心管在超净台内放置 留的乙醇充分挥发掉以免对后面的试验造成影响。 保存。基因和基因的 扩增 参照 说明书进行反转录 反应采用 此体系 反应体系见表。加入样品后 瞬时离心以保证反应液聚集在离心管的底部 将离心管 置于仪按以下程序进行反应 终止反应。 山东地区砸型和罐眯的变异分析及致病性比较 扩增体系试剂 筋总体积用扩增的产物做模板进行扩增 反应为 体系 见表。的 变性 退火 延伸 反应程序为 预变性 循环数最后延伸 表扩增体系试剂 剂量 总体积基因和基因的产物鉴定 去离子水 配制 的琼脂糖凝胶 用电子天平称取 琼脂糖 加入 微波炉加热至完全融化 室温冷却至。 滴加少量 选择 合适的胶槽和梳子 将上述琼脂糖溶液倒入胶槽 待其冷却凝固后即可将梳子拔出。 取此产物与适量的 混匀后加入凝胶板的样品槽 最后加入 标准。将上述凝胶板放入电泳槽 通电 、电流 左右 用凝胶成像仪观察结果。 基因和基因的产物的纯化 山东农业人学硕一学位论文 用琼脂糖凝胶纯化试剂盒对产物进行纯化。 平衡液 平衡硅胶柱。取一个新的 结合柱装在收 吸取平衡缓冲液至柱子中 室温放置 室温下 离心 倒弃收集管中的滤液 从凝胶上害下带有目的片段的凝胶块到或者 离心管中 加入倍体 称量或者估计凝胶的重量确保加入不少于倍体积的 置于。 。水浴中 期问颠倒混匀几次 直至凝胶块完全溶化。 冷却离心管至室温。 转移以上混合液每次不超过 至一个带有收集管的吸附柱中 室温下 离心 倒掉收集管中的废液 将吸附柱放回到收集管中 重复步骤 直至剩余的混合液全部通过吸附柱。加入 至吸附柱中 室温下离心 倒掉收集管中的 废液 将吸附柱放回到收集管中 重复步骤。 室温下 将吸附柱开盖离心去除残留的乙醇。 转移吸附柱至 收集管中 加入 。预热的 或者 到吸附柱膜中央 室温放置 将洗脱液加回到吸附柱中重新洗脱一次。取此样品凝胶电泳估计含量。

  制成匀浆反复冻融三次以促进组织细胞裂解病毒释放 然后 上清置于另一灭菌管内并加入用缓冲液或生理盐水稀释的青 霉素和链霉素终浓度为万单位每毫升 。冰箱放置 。在无菌环境下将病毒 孵化内正常死亡或未死亡的鸡胚在冰箱内放置一段时间使鸡胚的血管收缩 然后 无菌环境中收获尿囊液。反复传代 放置。备用。 病毒的<

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